核酸释放新纪元：一步免提，极速赋能

一、核心原理 

一步法免提取核酸释放剂是一种通过简化传统核酸提取步骤、直接在裂解液中释放核酸并用于后续检测的技术所运用的试剂^[1]。该技术实现了核酸的快速释放和保护，核心是无需离心、洗涤或纯化步骤，能显著缩短检测时间，同时具有操作简便、兼容性强等优点，特别适用于需要高通量、快速筛查的场景，如临床诊断和大规模筛查^[2]。

其具体作用机制如下： 

（一）化学裂解 1. 碱性环境破坏细胞结构^[3]：核酸释放剂通常含有强碱性物质（如NaOH或KOH）。这些强碱能提供碱性环境，使细胞膜和病毒包膜等结构发生变性，从而破坏细胞结构，导致核酸从细胞或病毒颗粒中释放出来。 

2. 非离子型表面活性剂加速裂解^[4]：非离子型表面活性剂如Triton X-100等，能够加速细胞外膜蛋白和脂类的溶解，进一步促进细胞裂解，加快核酸的释放。同时，这些表面活性剂还能对核酸特别是单链RNA起到保护作用，防止其在碱性环境中被降解。 

（二）核酸保护 

1. 金属离子螯合剂抑制核酸酶活性^[4]：核酸释放剂中常含有金属离子螯合剂（如EDTA），EDTA能够螯合溶液中的金属离子，如Mg²⁺、Ca²⁺等，这些金属离子是核酸酶（如DNA酶和RNA酶）的必需激活剂。通过螯合这些离子，EDTA可以抑制核酸酶的活性，从而防止核酸被降解。 2. RNA酶抑制剂保护RNA：对于RNA病毒或需要提取RNA的样本，核酸释放剂中可能添加了RNA酶抑制剂，如RNase inhibitor（RRI）。这些抑制剂能够特异性地抑制RNA酶的活性，进一步保护RNA的完整性。 

（三）杂质去除 ^[5][6]

1. 蛋白质变性和沉淀：在碱性条件下，蛋白质会发生变性，形成沉淀。这些沉淀可以通过离心或静置的方式去除，从而减少蛋白质对后续PCR扩增的干扰。

 2. 其他杂质的去除：核酸释放剂中的某些成分还能够去除其他杂质，如多糖、脂类等。例如，阳离子去污剂CTAB能够在高离子强度溶液中与蛋白质和多糖形成复合物，从而去除这些杂质。 

二、特点与优势 

（一）快速释放 核酸释放剂通常在室温下即可完成裂解和核酸释放过程，无需进行高温加热或复杂的操作步骤。通常核酸释放剂在室温下静置1-10分钟即可完成核酸释放。 

（二）兼容性 

1. 直接用于PCR扩增：释放的核酸可以直接用于后续的PCR扩增或其他分子生物学实验，无需进行进一步的纯化和洗脱步骤。这大大简化操作流程，减少了核酸损失，提高了检测效率。

 2. 多种样本类型：核酸释放剂可以兼容多种样本类型，如血清、血浆、全血、拭子、组织等。

 3. 下游应用兼容：释放的核酸可以用于多种下游应用，如PCR、RT-PCR、qPCR、测序等。 

（三）高灵敏度和稳定性 核酸在溶液中保持完整性和稳定性，检测限（LOD）较低。且常温裂解避免加热导致的气溶胶污染，减少假阳性风险。 

（四）适用范围 

1. 适用样本类型 - 拭子类样本：如咽拭子、鼻拭子、眼结膜拭子、宫颈拭子等，直接与释放剂混合后即可快速释放核酸。 - 液体样本：包括病毒保存液、血清、血浆、全血、唾液、脑脊液、尿液等。 

2. 检测的病原体类型 - 病毒：如SARS-CoV-2、HBV、HCV、HPV、H1N1、RNA病毒等。 - 细菌与微生物：如大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌、隐球菌等。 

三、局限与不足 

（一）抑制物干扰风险 

1. 部分试剂中含表面活性剂（如SDS、Triton X-100）或离液盐（如盐酸胍），可能抑制后续扩增反应，需通过稀释或添加中和剂解决。

 2. 复杂样本（如全血、高黏度分泌物）中的血红蛋白或黏液可能残留，影响检测灵敏度。 

（二）灵敏度差异 对低浓度样本的检测灵敏度较低（如病毒载量＜20 IU/mL），易导致假阴性。 

（三）标准化与质量控制挑战 

1. 不同品牌试剂的成分差异较大（如pH、表面活性剂浓度），导致检测结果可比性低。 

2. 缺乏统一的内标质控体系，可能因样本处理不均一导致假阴性或假阳性。 

（四）样本兼容性限制

 1. 对于含高浓度核酸酶或脂类物质的样本（如粪便、组织匀浆），一步法可能无法完全抑制酶活，导致核酸降解。

 2. 部分试剂对拭子材质或保存条件敏感，需严格按说明书操作以避免核酸损失。

 四、使用方法 

（一）液体样本 ^[7]

1. 样本采集：将约2μL液体样品（如全血、细胞培养液、病毒样品、粪便样品）加入到50μL免提取核酸释放剂中。（注意：总液体样品用量不要超过本产品用量的1/10）

 2. 裂解处理：室温放置3分钟；对于较难裂解的样品（如有厚壁的真菌等），则保温时间可以延长到10-30分钟。 

3. 振荡混匀：振荡混匀后取样品裂解液直接进行PCR扩增或其他扩增。（注意：裂解液体积最好不要超过反应体积的1/10，由于不同的扩增体系成分不同，建议做梯度测试以确定最佳反应体系） 

（二）组织样本

 1. 样本采集：将约1-2mg的固体样品（如动物组织、植物叶片、种子等）加入到50μL免提取核酸释放剂中。（注意：总样品量不要超过1mg/10μL的比例）

 2. 裂解处理：95℃加热5分钟；对于较难裂解的样品（如石蜡组织切片、血斑等），则保温时间可以延长到10-30分钟。

 3. 振荡混匀：振荡混匀后取样品裂解液直接进行PCR扩增或其他扩增。（注意：裂解液体积最好不要超过反应体积的1/10，由于不同的扩增体系成分不同，建议做梯度测试以确定最佳反应体系） 

（三）常规样本 

1. 样本采集：将采样后的拭子折断，含有样本的拭子头浸没于含有样本释放剂的采样管里。（或者取采样管中的样本与样本释放剂以体积比为1:1相混合） 

2. 振荡混匀：漩涡震荡15秒，室温静置10分钟后吸取上层液体（底部有少量沉淀，避免吸取底部液体）进行后续PCR检测。 

 五、注意事项 ^[8]

1. 样本与释放剂的比例：确保样本与核酸释放剂的比例适当，一般为1:1或根据具体产品说明进行调整。 

2. 裂解时间：根据样本类型和难易程度，裂解时间可能需要调整，一般为3-30分钟不等。 

3. 振荡混匀：确保样本与释放剂充分混匀，可以使用漩涡振荡器或手动振荡。 

4. 避免污染：操作过程中应注意避免样本间的交叉污染，使用无菌耗材和操作台。 

5. 后续PCR反应：裂解后的样本可以直接用于PCR扩增，但需要注意裂解液的加入量不要超过PCR反应体系的1/10，以避免影响扩增效果。

(六) 专利[配方及原理]

产品介绍

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参考文献

[1] 雷洋，汪大明，陈凯君，洪晗露，陈志达，白佳委.一种免提取快速核酸释放剂及其制备方法和使用方法[P].中国专利：CN114990192A,2022.09.02

[2] 刘娜, 王亚平, 王学硕, 崔胜辉. 九种核酸提取裂解试剂对PCR扩增效率的影响研究. 中国食品卫生杂志, 2023, 35(6): 843-848.

[3] 刘婷, 欧阳政德, 吴文金, 林孝德, 冯志刚. 两种不同释放剂核酸提取法的新型冠状病毒RT-PCR内标检测结果比较. 中国热带医学, 2021, 21(2): 186-190. 

[4] 陈大为，陈龙，李佳慧，王秀艳，孙玉凤.一种一步法快速提取核酸的释放剂及其制备和使用方法[P].中国专利：CN111808847A,2020.10.23

[5] "Effective and economical column-based method for RNA isolation from animal cells" by Niu, Q. et al. (2019)

[6]李冉冉 et al. (2018). 不同RNA提取方法的效能比较. 法医遗传学杂志. 

[7] "Spin Column-Based Isolation of Nucleic Acid" by Gautam, A. (2022)

[8] "Effective and economical column-based method for RNA isolation from animal cells" by Niu, Q. et al.