解密RNase A:去除DNA污染的神奇密码

一、RNase A 的定义

核糖核酸酶A（Ribonuclease A，RNase A）是一种可以特异性地攻击RNA上的嘧啶残基3’端与相邻的核苷上的5’端核糖，最终生成嘧啶3’磷酸及末端带嘧啶3’磷酸的内切核糖核酸酶。

二、RNase A的作用机制

RNase A的作用机制可总结为以下3个主要步骤：

（1）对底物的特异性识别

（2）催化位点对底物的结合

（3）进行水解反应

1、对底物的特异性识别

RNase A对底物识别的特异性主要依赖于：

① 碱基识别特异性

② 结构识别特异性

③ 催化位点作用特异性

RNase A会优先识别单链RNA分子中的嘧啶碱基（胞嘧啶和尿嘧啶）的3’端位置并在其3’端进行切割。RNase A活性中心是类似于一种“口袋”结构，其大小与结构特征恰好可以容纳嘧啶的碱基结构，并且可以通过氢键与疏水作用实现与底物RNA分子的紧密结合。

RNase A的活性中心更易于容纳单链的RNA分子，且当RNA单链与酶接近时，RNase A的“口袋”结构会根据底物的具体结构进行微调，形成一个更加契合底物分子并且具有催化活性的复合物。单链的RNA分子的柔性以及可接近性使得它更容易被RNase A结合并被催化水解。

2、催化位点对底物的结合

RNase A的活性位点包括两个关键组氨基酸残基（His12和His119）和一个赖氨基酸残基（Lys41），协同水解反应的进行。

His12作为广义碱，从RNA提取质子生成2’-氧阴离子，2’-氧阴离子攻击相邻的磷酸二酯键，形成2’,3’-环磷酸中间体。

His119作为广义酸，向5’-OH基团提供质子，完成水解反应的进行，生成3’-磷酸末端产物。

3、进行水解反应

RNase A对底物的水解完成后，释放已被切割的底物RNA片段，再进行下一轮的催化反应。

三、RNase A的作用条件

RNase A是一种有较高稳定性的酶，其活性与功能性依赖于特定的反应条件，对于RNase A的作用条件可总结为以下几点：

（1） pH值范围在中性或弱碱性（pH=7.0~8.0）

（2） 作用温度在37℃左右

（3） 受离子强度的影响

（4） 抑制剂会影响其活性

RNase A有比较广泛的pH适用范围，反应条件极广，热稳定性好，且经过高温或变性剂作用后也容易复性。它也具有高度的专一性只作用于RNA，对蛋白质与DNA无影响。在低浓度离子环境（NaCl/KCl）中可增强其活性，在高离子浓度中（>300mM）其反应活性可能会被抑制。与其他核酸酶不同，它的活性不依赖于二价阳离子，但会受到抑制剂和某些离子的影响的影响。

四、应用场景

RNase A作为一种多功能酶在与RNA相关的研究中具有不可替代的作用，在去除RNA的污染、RNA的纯化与分析、基因的表达与调控、RNA结构与功能以及RNA代谢与降解途径等研究中广泛地应用。

去除RNA污染

由于DNA与RNA的高度相似性，当DNA样品中混入了RNA，会导致假阳性结果的出现，会误导实验结果的分析。因此去除DNA样品中的RNA污染是生物实验中的一大重点与难点。下面将对在获取纯化DNA样本去除RNA污染中的应用以及注意事项展开重点介绍：

具体操作流程如下：

（1）样品的准备与提取

A. 组织样本

取新鲜组织（10-25mg），液氮冷冻敲碎研磨，加入组织裂解液GHA（200-300μl），加入20μl蛋白酶K充分混匀，适宜温度（55~65℃）下裂解消化至无明显组织块，裂解后样本呈粘稠状。

B. 细胞样本

a. 悬浮细胞

细胞培养液1500r，4℃离心10min,弃上清，收集细胞（>5*10^6个细胞）重悬于200μl的PBS中。

b. 贴壁细胞

用刮刀刮下或胰酶消化后制备细胞悬液，离心弃上清，收集细胞（>5*10^6个细胞）重悬于200μl的PBS中,加入20μl的蛋白酶k，充分混匀。

（2）加入RNase A酶及其缓冲液

在进行RNase A处理之前确保DNA样品处于合适的缓冲溶液体系中（一般为Tris-EDTA（TE）缓冲液），以保证RNase A在此缓冲液反应体系中具有较高的生理活性。在加入缓冲溶液后再按一定的比例加入RNase A（一般为每20μl的DNA样品中加入10mg/ml的RNase A 2μl），然后轻轻摇匀样品。

（3）进行孵育反应

将样品置于37℃环境中孵育3-4h，并持续缓慢振摇，使RNase A处于反应活性最高的生理状态。

（4）进一步纯化处理

孵育结束后，对样品进行进一步的纯化处理。（如磁珠法、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等）

常用纯化方法（以磁珠法为例）

在上述样品溶液中加入裂解液GHL和异丙醇溶液，充分轻柔混匀，加入15~20μl磁珠悬液（使用前需充分混匀），室温放置3~10min，置于磁力架上，待磁珠被完全磁吸后，去除净残液。再使用洗涤液对磁珠进行洗涤处理，再使用洗脱液分离磁珠上的DNA。

在提取纯净DNA去除RNA污染需要注意以下事项：

（1）确保RNase A处于较高的活性

高质量活性可靠的RNase A对催化反应更加有利，需注意保存条件（如-20℃）且避免反复冻融。

（2）反应的条件控制

温度和反应时间是影响反应进行关键因素，严格控制孵育的温度与时间，确保反应的充分进行以及保证DNA处在良好的生理状态。反应温度过低或过高会影响酶促反应的速率，反应时间过短可能会导致反应不充分，反应时间过长可能会导致DNA受到损伤。

（3）避免DNA的损失与降解

在整个操作流程中要轻柔，避免剧烈震荡、反复吹打使DNA断裂的可能性增大。

（4）去除残余的RNase A

使用RNase A处理后可能会有残余，残留的RNase A在后续的实验中可能会对DNA造成影响，需要通过一定的方法（如加热灭活、柱纯化法等）除去。

五、产品介绍