核酸提取经典技术 —— 酚-氯仿法的原理与应用

酚-氯仿法是分子生物学领域核酸提取的经典方法，基于核酸与细胞杂质在有机相和水相的分配差异实现分离纯化，凭借提取效率高、核酸完整性好、成本低廉等优势，至今仍是基础科研与常规检测中核酸提取的核心手段，也是理解核酸分离纯化原理的重要载体，为PCR扩增、酶切、测序、克隆等后续分子生物学操作提供高质量核酸模板。本文从核心原理、试剂组成、操作流程、适配场景、优劣势、优化技巧及方法对比等方面进行系统综述，为该方法的规范应用与优化提供参考。

一、酚-氯仿法的核心提取原理^[1]

酚-氯仿法的核心逻辑为蛋白变性与相分离，通过有机试剂的理化特性实现核酸与蛋白质、脂质、多糖等杂质的高效分离，同时通过pH调控和醇沉作用实现核酸的纯化与富集，核心原理分为四部分：

1.蛋白质变性失活：酚为弱酸性有机试剂，可破坏蛋白质的二级和三级结构使其变性；氯仿可增强酚的蛋白变性效果，同时促进变性蛋白质凝聚沉淀，避免其与核酸结合形成复合物，保证核酸游离。

2.相分层与杂质分离：酚-氯仿按比例混合后与水相裂解液振荡混匀，会形成清晰的两相体系——下层有机相（酚-氯仿相）、上层水相。核酸为极性大分子，不溶于有机相，稳定存在于水相；变性蛋白质、脂质、多糖等非极性杂质则进入有机相，中间层吸附微量未沉淀杂质，实现核酸与杂质的初步分离。

3.pH值的关键调控：提取体系的pH值决定核酸的相分配位置，是核心调控点。pH＞7.0时，核酸带负电，稳定存在于水相，适用于基因组DNA、质粒DNA提取；pH4.0-5.0时，RNA仍保留在水相，DNA与酚发生氢键结合进入有机相，可实现RNA与DNA的高效分离^[2]。

4.醇沉富集核酸：酚-氯仿抽提后的水相核酸，在高盐环境下（醋酸钠/氯化钠），经异丙醇或无水乙醇处理后，核酸分子氢键被破坏、脱水凝聚形成沉淀，离心后即可获得核酸沉淀，经洗涤、干燥后溶解，得到高纯度核酸^[3]。

二、核心试剂组成及作用

酚-氯仿法的试剂配制需严格控制纯度，避免杂质污染或破坏核酸结构，核心试剂及作用如下，提取RNA时需额外添加无酶试剂和RNA酶抑制剂^[4]：

  表1

三、通用规范操作流程

酚-氯仿法操作流程可根据样本类型微调，核心步骤一致，全程需低温操作（冰浴/4℃），避免核酸酶降解核酸，严禁剧烈振荡，防止核酸链断裂，通用流程共8步，耗时30-60min：

1.样本前处理与细胞裂解：将研磨后的组织、细胞沉淀、菌体等样本加入裂解缓冲液，充分混匀；根据需求加入蛋白酶K（55℃水浴1-2h）或SDS，彻底破坏细胞结构，释放胞内核酸^[5]。

2.酚-氯仿抽提：向裂解液中加入等体积酚-氯仿-异戊醇混合液，轻轻上下颠倒10-15次混匀，室温12000r/min离心10min。

3.水相吸取：离心后体系分三层（上层水相/中层蛋白杂质/下层有机相），用无菌宽口枪头小心吸取上层水相至新离心管，保留少量水相不吸取，避免杂质污染。

4.二次抽提（可选）：对纯度要求较高的核酸，重复酚-氯仿抽提步骤，进一步去除残留蛋白质杂质。

5.核酸沉淀：向水相中加入1/10体积3mol/L醋酸钠，混匀后加入0.6-0.8倍异丙醇或2倍无水乙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10-15min（低浓度核酸可-20℃放置30min-1h）。

6.离心收集沉淀：12000r/min室温离心10-15min，弃上清，离心管底部可见白色/透明核酸沉淀。

7.洗涤与干燥：加入1-2mL75%乙醇洗涤沉淀，10000r/min离心5min，弃上清，重复1-2次；将离心管倒扣在无菌滤纸上，室温干燥5-10min，避免过度干燥导致核酸难以溶解。

8.核酸溶解：根据沉淀量加入适量TE缓冲液或无酶水，轻轻吹打混匀，4℃放置30min或室温10min，充分溶解后即可用于后续实验或-20℃/-80℃保存。

四、适配场景与样本类型

酚-氯仿法适配性广，可处理多种样本类型，提取不同类型核酸，是样本复杂、需求多样时的优选方法，核心适配场景如下：

1.适配核酸类型：基因组DNA、质粒DNA、总RNA，通过调整酚的pH值、添加辅助试剂可实现针对性提取，如pH4.5+DEPC处理可提取纯RNA，温和裂解+RNaseA处理可纯化质粒DNA。

2.适配样本类型：动物组织/血液/细胞培养物、植物组织（叶片/根/茎）、微生物（细菌/真菌/酵母）、粪便样本、环境样本（土壤/水体）等；植物样本需提前加PVPP去除多酚，血液样本需加红细胞裂解液去除红细胞^[6-10]。

3.适配实验需求：对核酸纯度和完整性要求较高的后续实验，如PCR/实时荧光定量PCR、核酸电泳、酶切反应、基因克隆、核酸测序、Southern/Northern杂交等，提取的核酸A260/A280比值可达DNA 1.8-2.0、RNA 1.9-2.1，符合高质量核酸标准。

五、优势与局限性

（一）核心优势

1.提取效果佳：细胞裂解彻底，核酸回收率高，操作温和，不易导致核酸链断裂，提取的核酸片段完整（可达几十kb），适合长片段核酸提取。

2.核酸纯度高：多次酚-氯仿抽提可彻底去除蛋白质、脂质等杂质，无酶类和载体蛋白污染，满足高精度实验需求。

3.成本低廉：核心试剂（酚/氯仿/乙醇）均为常规分子生物学试剂，易采购、价格低，相较于商业化试剂盒，可大幅降低大规模样本提取成本。

4.灵活性强：可根据样本类型、核酸类型和实验需求，灵活调整试剂比例、pH值、抽提次数，无需严格遵循固定流程，操作门槛低。

（二）主要局限性

1.试剂具有毒性腐蚀性：酚强腐蚀性，氯仿具有挥发性和毒性，长期接触危害人体健康，操作需在通风橱内进行，且需做好全套防护。

2.操作繁琐耗时：涉及多次抽提、离心、沉淀步骤，相较于商业化试剂盒，耗时更长，不适合应急实验和高通量样本提取。

3.部分样本前处理复杂：多酚、多糖含量高的植物样本和杂质多的环境样本，直接提取易出现核酸与杂质结合，需提前脱酚、脱糖处理。

4.RNA提取难度高：RNA酶广泛存在且耐高温、耐酸碱，若试剂/耗材未严格无酶处理，极易导致RNA降解，实验成功率低于DNA提取。

六、操作注意事项与优化技巧

（一）核心操作注意事项

1.全程低温防护：核酸酶室温下活性高，全程冰浴/4℃操作，采用低温离心机，防止核酸降解；提取RNA时，所有耗材经DEPC处理并高压灭菌，试剂用0.1% DEPC水配制^[11]。

2.避免剧烈操作：混匀酚-氯仿与裂解液时，轻轻上下颠倒，严禁剧烈振荡，防止基因组DNA断裂；吸取水相使用宽口枪头，避免枪头吸附核酸导致损失。

3.规范吸取水相：吸取时枪头避免接触中层和下层，保留少量水相，防止杂质污染；若水相被污染，需立即重新抽提。

4.废液规范处理：实验后的有机废液单独收集，交由专业机构处理，不可随意排放；酚溅到皮肤/黏膜后，立即用大量清水冲洗，再用稀氨水/酒精擦拭。

5.防止交叉污染：所有耗材无菌无酶，操作过程中佩戴一次性无粉手套，避免用手接触耗材内壁，不同样本分开操作。

（二）针对性优化技巧

1.提升核酸纯度：A260/A280比值偏低（含蛋白杂质），增加抽提次数或提高蛋白酶K浓度/水浴时间；DNA中含RNA杂质，加入RNase A（37℃水浴30min）降解RNA。

2.减少核酸损失：低浓度核酸提取时，-20℃延长沉淀时间至1h，或加入糖原作为载体促进沉淀；干燥沉淀时避免过度干燥，若沉淀难以溶解，可55℃水浴轻微加热^[12]。

3.优化植物样本提取：研磨时加入PVPP吸附多酚，裂解液中加入高浓度NaCl，抑制多糖与核酸结合，减少多糖杂质^[13]。

4.优化RNA提取：操作全程佩戴无粉手套，使用无酶耗材，提取后立即溶解并-80℃保存，避免反复冻融；可在裂解液中加入RNA酶抑制剂，提升RNA完整性。

5.简化操作流程：常规实验对纯度要求较低时，可减少抽提次数至1次；沉淀后用无水乙醇快速洗涤，缩短实验时间。

七、与其他核酸提取方法的对比

分子生物学领域常用核酸提取方法还有硅胶柱法、磁珠法、盐析法，不同方法原理、优劣势和适配场景差异显著，可根据实验需求、样本类型和实验室条件选择，核心对比如下表^[14-15]：

表2

八、酚-氯仿法的改良与发展

随着分子生物学技术的发展，酚-氯仿法不断结合其他方法优势进行改良，弥补自身局限性，主要改良方向包括：

1.试剂配方改良：开发酚-氯仿-异硫氰酸胍混合试剂，结合异硫氰酸胍的强裂解和RNA酶抑制作用，实现RNA的快速高效提取，成为TRizol法的核心原理^[16]。

2.与固相提取结合：将酚-氯仿抽提后的水相通过硅胶柱吸附洗脱，结合酚-氯仿法杂质去除彻底和硅胶柱法快速提取的优势，兼顾纯度与效率^[17]。

3.自动化适配：将酚-氯仿法操作流程整合到自动化核酸提取仪中，通过机械臂完成抽提、离心、沉淀等步骤，实现高通量样本自动化提取，适合大型实验室和检测机构^[18]。

4.低毒试剂替代：开发无酚、低毒的有机试剂替代传统酚-氯仿，在保证提取效果的前提下，降低操作风险，提升实验安全性^[19]。

九、总结与展望

酚-氯仿法作为核酸提取的经典方法，历经数十年发展，仍是分子生物学基础科研的核心手段，其高纯度、高回收率、低成本的优势，使其在实验室常规实验、大规模样本提取和低成本实验中仍具有不可替代性，同时也是理解核酸分离纯化原理的重要载体，为其他核酸提取方法的开发奠定了基础。

尽管当前核酸提取技术朝着快速、高通量、无毒性、自动化的方向发展，商业化试剂盒和自动化提取设备逐渐成为主流，但酚-氯仿法并未被淘汰，而是通过试剂改良、流程优化和与自动化技术的结合，不断提升适用性。未来，随着低毒、高效替代试剂的开发和自动化操作体系的完善，酚-氯仿法将进一步降低操作风险、提升提取效率，继续在核酸提取领域发挥重要作用，为基础科研和临床检测提供更可靠、高效的核酸提取方案^[20-21]。

附：酚-氯仿法核酸提取关键试剂配制表

酚-氯仿法核酸提取关键试剂配制表.docx

参考文献：

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