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10× Loading buffer上样缓冲液：原理、精准配方与应用全攻略

发布时间：2026-03-21 点击次数：1

1.简介

核酸凝胶电泳是分子生物学中用于分离、鉴定和定量核酸的经典技术。在电泳操作中，上样缓冲液会直接影响样品沉降效果、电泳进程观察与条带质量。10× Loading buffer^[1]由溴酚蓝、二甲苯氰、甘油、EDTA组分构成，是一种10倍浓缩核酸凝胶电泳上样缓冲液，适用于琼脂糖凝胶电泳和非变性丙烯酰胺凝胶电泳。使用时将其与样品充分混匀并稀释至1×浓度，溶液比重仍然较大，上样时易沉入点样孔，且呈现出清晰的蓝色指示条带，便于观察样品上样效果与电泳进程，显著提升了实验操作的便捷性与准确性。

2.功能和作用原理

2.1指示上样和电泳进程

10× Loading buffer含有溴酚蓝和二甲苯氰两种蓝色染料。溴酚蓝和二苯甲氰能指示样品是否充分沉入加样孔，以及显示核酸电泳迁移进程，以便判断电泳进度，适时终止电泳。溴酚蓝是一种pH指示剂，在常规电泳的碱性凝胶环境下，可维持稳定的蓝色。在0.5% - 5% 的琼脂糖凝胶中，它的迁移位置大致于^[2]12bp-1150bp;在非变性丙烯酰胺凝胶中，它的迁移位置大致于12bp-100bp。因此常被用于电泳指示染料。

二甲苯氰通常呈现蓝色，在电泳过程中颜色相对稳定；二甲苯氰的分子量比溴酚蓝大，迁移率比溴酚蓝慢^[3]，在0.5% - 5% 的琼脂糖凝胶中，它的迁移位置大致于105bp-16700bp;在非变性丙烯酰胺凝胶中，它的迁移位置大致于45bp-460bp。

2.2增加样品密度

甘油是10× Loading buffer的核心密度调节组分，可提高样品的密度，使样品上样后沉降至点样孔底部，有效防止样品在电泳缓冲液中扩散或飘出点样孔，从而保证电泳条带清晰和实验结果准确。

2.3维持核酸迁移与稳定

乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-2Na）是的化学式为C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈，其分子结构中含有两个氮原子和四个氧原子，易与金属离子结合形成稳定六齿螯合剂，对重金属有很高的螯合效率^[4]。因此在DNA和RNA的电泳缓冲液中，EDTA像一个“分子钳子”，能够牢牢抓住并结合溶液中的游离金属离子，当EDTA清除了这些辅助因子后，溶液中即使存在微量的核酸酶，也会因为“缺钙”而失去活性，无法降解核酸，从而保持核酸稳定。

3.配制方法

3.1配制10× Loading buffer各组分浓度^[5]

表3-1 10× Loading buffer各组分浓度

成分	浓度
溴酚蓝（Bromophenol Blue）	0.25% (W/V)
二甲苯氰（Xylene Cyanol FF）	0.25% (W/V)
甘油（Glycerol）	50% (V/N)
EDTA	10 mM

3.2配制步骤

取一支洁净的10 mL 离心管，准确量取200μL的0.5M EDTA（pH8.0）和称取25mg的溴酚蓝以及25mg的二甲苯氰加入10mL离心管中，再向离心管中加入约4mL的DEPC处理水后，置于涡旋混匀器充分振荡，直至完全溶解；加入5mL的甘油，充分混匀；用DEPC处理水定容至10mL，室温保存。