ARTICLE技术文章

qPCR预混液全解析：看懂成分，实验不慌

发布时间：2026-07-13 点击次数：1

做qPCR最崩溃的时刻是什么？引物设计没问题、操作步骤没出错，结果却总是扩增曲线杂乱、Ct值漂移、重复性时好时坏。当你排除了引物设计和模板质量问题后，预混液的配方和操作细节往往是决定成败的最后一公里。试剂基底细微的偏差，都会被荧光定量PCR无限放大。

今天一文讲透qPCR Mix的核心配方，看懂成分，实验不慌。

一、qPCR Mix里到底有什么？

市面上的qPCR预混液通常是2×浓缩液，使用时只需加入模板和引物即可。核心成分包括：

部分高端预混液还额外添加了UDG酶和dUTP，用于防止PCR产物的气溶胶交叉污染。

热启动技术的两种实现方式：抗体封闭型通过在低温下抗体与Taq酶结合抑制其活性，高温变性时抗体失活释放酶活性；化学修饰型通过化学基团在低温下封闭酶活性中心，高温加热后脱除修饰基团恢复活性。两者原理不同，但目标一致——降低非特异性扩增，提高灵敏度。

参照主流qPCR操作规范：[3]

组分	储存浓度	单孔体积 (μL)	反应终浓度	关键实操备注（必看）
2× qPCR Mix	2×	10	1×	从-20℃取出后手指搓融，涡旋瞬离，禁止水浴加热
上游引物	10 μM	0.4（可调至0.8）	0.2 μM（可调至0.4）	上下游引物体积必须相等；效率不佳时再同步加倍
下游引物	10 μM	0.4（可调至0.8）	0.2 μM（可调至0.4）	同上
模板DNA/cDNA	视类型而定	按右侧要求加入	视实验而定	质粒：1 μL（含10 pg~1 ng） cDNA：2 μL（原液必须稀释10~20倍后取用） gDNA：1 μL（含10~100 ng）
无菌超纯水	—	计算公式：9.2 - 模板体积(μL)	—	例：模板2 μL → 加水 9.2-2 = 7.2 μL
总体积	—	20	—	建议每孔预混液总量多配10%~15%，补偿移液损耗

关键提醒（实验党必看）：

1. 冰上操作：所有试剂在冰上解冻、配制，防止酶提前激活。

多配10%：考虑移液损耗，每个基因的反应体系至少多配10%。

充分混匀+离心：每步预混液配制完成后必须涡旋混匀并短暂离心，确保成分均一。

2. 避光操作：SYBR Green荧光染料在自然光下不稳定，长期光照会导致荧光背景显著升高和灵敏度下降，建议全程避光操作，且室温放置时间不宜超过30分钟。

3. 设置NTC：无模板对照验证体系是否被污染

4. 扩增结束后务必运行熔解曲线程序（65℃升至95℃，采集荧光），确认产物为单一特异性熔解峰。若出现双峰或多峰，说明存在非特异性扩增或引物二聚体，数据不可用。

实拍图.jpg

配方虽然清晰，但每次实验都要精确移取多种组分——引物、酶、dNTP、缓冲液——不仅繁琐，还容易引入误差。更头疼的是，自己配制的Mix批次间稳定性难以保证，稍微有点偏差，数据就“飘”了。

杭州富沃克生物推出的qPCR高灵敏预混液，采用化学修饰热启动Taq酶，常温下完全抑制酶活性，杜绝室温配制时的非特异性结合。体系内含高纯度dNTP、均衡镁离子浓度与专用扩增稳定剂，扩增效率稳定维持在90%~110%。关键是——开盖即用，只需加入引物和模板。

产品名称	规格	产品货号
qPCR mix	1ml	FQP606-01

厂家联系微信号：19850855600

微信二维码.jpg

[1] 实时荧光定量PCR预混液（2×SYBR Green Mix）产品说明，欧凯生物

[2] 2×HSYBR qPCR Mix产品说明，北京庄盟国际生物

[3] Seebio®热启动Taq酶qPCR预混液(2X) (UDG plus)产品页面，西宝生物