蛋白条带“显形剂”：考马斯亮蓝R-250染色液配制全攻略

在蛋白质电泳实验中，考马斯亮蓝R-250染色液是最常用的蛋白显色试剂，被誉为“蛋白显色能手”。其核心功能是与蛋白质特异性结合，快速呈现清晰的蛋白条带，广泛适配SDS-PAGE、Native-PAGE等各类蛋白电泳的染色步骤，用于蛋白纯度鉴定、蛋白条带定位、蛋白定量初步筛选等实验场景。该染色液配制简便、显色快速、灵敏度适中，且成本低廉，是分子生物学、蛋白研究实验室中不可或缺的核心试剂，其配制准确性、组分均一性直接影响蛋白条带的清晰度与实验结果的可靠性。

考马斯亮蓝R-250的显色原理简洁明确：其分子结构中含有疏水基团和酸性基团，在酸性条件下，酸性基团可与蛋白质分子中的碱性氨基酸（如赖氨酸、精氨酸）形成离子键，同时疏水基团与蛋白质的疏水区域发生疏水相互作用，形成稳定的蓝色复合物。该复合物在595 nm波长处有最大吸收峰，可通过肉眼直接观察到蓝色蛋白条带，且在一定范围内，蛋白含量与染色强度呈线性关系，可辅助进行蛋白定量分析。

染色液中各组分协同作用，缺一不可：考马斯亮蓝R-250作为核心显色剂，决定染色灵敏度与条带颜色深浅；异丙醇作为助溶剂，可增加考马斯亮蓝R-250的溶解度，避免其析出沉淀，同时辅助蛋白变性，促进染料与蛋白结合；冰醋酸提供酸性环境，为离子键形成创造条件，同时固定蛋白质，防止蛋白条带扩散，提升条带清晰度；去离子水用于调节总浓度，确保各组分比例均衡，保障染色效果稳定。

考马斯亮蓝R-250染色液（1 L 装）精准配方如下：

考马斯亮蓝R-250染色液（1 L 装）精准配方.pdf

⚠️ 实验关键注意事项：

1.  安全操作规范：染色液中含有异丙醇（易挥发、易燃）和冰醋酸（具有腐蚀性、刺激性），配制时需在通风良好的实验区域操作，远离火源、热源；避免冰醋酸、异丙醇接触皮肤、黏膜，若不慎接触，立即用大量去离子水冲洗15分钟以上，必要时及时就医；严禁用手直接接触考马斯亮蓝R-250粉末及染色液。

2.  废液处理要求：该染色液属于有机废液（含异丙醇、冰醋酸），严禁直接倒入下水道，否则会污染环境、腐蚀管道；实验结束后，废弃的染色液、染色后的废液，需统一收集到专门的有机溶剂废液桶中，做好标记，交由专业机构集中处理，严格遵循实验室废液处理规范。

3.  配制操作要点：配制时需严格遵循“先加异丙醇溶解考马斯亮蓝→再加冰醋酸→最后加水”的顺序，切勿颠倒顺序（若先加水，考马斯亮蓝难以溶解，易析出沉淀）；各组分用量需精准控制，尤其是冰醋酸的用量，直接影响酸性环境，若冰醋酸用量不足，会导致蛋白条带扩散、染色不清晰，用量过多则会降低染色灵敏度。

4.  溶解与过滤要求：考马斯亮蓝R-250必须用异丙醇充分溶解后，再加入其他组分，未完全溶解的考马斯亮蓝会导致染色背景偏高、条带出现斑点；配制完成后务必过滤，去除杂质，确保染色液澄清透明。

5.  保存与使用规范：染色液室温避光保存即可，有效期约1-2个月，若发现溶液褪色、出现沉淀、浑浊，表明已失效，需丢弃重配；使用时，将电泳后的凝胶完全浸泡在染色液中，震荡染色30-60分钟（根据凝胶厚度调整），染色完成后用脱色液（异丙醇:冰醋酸:水=10:10:80）脱色至背景清晰、条带明显。

6.  其他注意事项：考马斯亮蓝R-250染色液对蛋白具有强结合能力，实验器皿沾染染色液后，需用温水加少量洗涤剂反复清洗，避免残留；染色过程中，凝胶需完全浸泡在染色液中，确保染色均匀，避免出现条带深浅不一的情况。

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