蓝白筛选“辨色密钥”：20mg/ml X-Gal 配制实操

在分子生物学克隆实验中，X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）是蓝白筛选的核心显色试剂，被誉为蓝白筛选的“显色密码”。其核心功能是作为β-半乳糖苷酶（LacZ酶）的底物，通过酶解反应呈现蓝色，精准区分重组质粒与非重组质粒转化的菌株，广泛适配质粒克隆、载体构建、基因片段插入验证等实验场景。作为克隆实验中不可或缺的关键试剂，X-Gal的配制纯度、浓度准确性、避光操作及保存条件，直接影响蓝白筛选的清晰度与判定准确性，是保障克隆实验高效开展、快速筛选阳性克隆的核心前提。

X-Gal的显色原理简洁且特异性极强：X-Gal本身为无色小分子化合物，可被大肠杆菌体内表达的β-半乳糖苷酶（LacZ酶）水解，生成5-溴-4-氯-3-吲哚（呈蓝色）和β-D-半乳糖。在蓝白筛选实验中，非重组质粒含有完整的LacZ基因，可表达有活性的LacZ酶，水解培养基中的X-Gal，使菌落呈现蓝色；而重组质粒因插入目的基因，破坏了LacZ基因的完整性，无法表达有活性的LacZ酶，菌落呈白色，从而实现重组克隆与非重组克隆的快速、直观区分，大幅提升阳性克隆的筛选效率。

20mg/ml X-Gal母液是实验室最常用的储备液浓度，配制核心依赖DMF（二甲基甲酰胺）作为助溶剂，且因X-Gal对光极度敏感、DMF易挥发且具刺激性，配制过程需严格遵循通风、避光操作规范，同时做好防护与保存，确保试剂活性不下降、显色效果稳定，可根据实验需求稀释至适宜工作浓度（通常为20μg/ml）适配筛选实验。

20mg/ml X-Gal 母液（50 ml 装）精准配方如下：

20mgml X-Gal 母液（50 ml 装）精准配方.pdf

⚠️ 实验关键注意事项：

1.  通风与防护规范：DMF（二甲基甲酰胺）易挥发、具刺激性，且长期接触会对人体造成危害，全程必须在通风橱内操作，严禁在开放环境中配制；操作时务必穿戴好护目镜、丁腈手套、实验服，避免DMF接触皮肤、黏膜，若不慎接触，立即用大量去离子水冲洗15分钟以上，必要时及时就医；严禁吸入DMF挥发气体。

2.  全程避光操作：X-Gal对光极度敏感，光线照射会导致其快速降解、丧失显色活性，因此称量、溶解、分装、保存全过程需严格避光——选用棕色器皿、弱光环境操作，分装后用铝箔纸包裹，保存时放置在冰箱避光处，避免任何形式的强光照射（包括实验室日光灯、阳光）。

3.  助溶剂选择要点：X-Gal仅能溶于DMF、DMSO等有机溶剂，不可用去离子水溶解（会导致X-Gal析出沉淀、失效）；配制时需选用纯度≥99.5%的无水DMF，避免DMF中含有水分影响溶解效率与试剂活性。

4.  分装与保存规范：X-Gal母液需小份分装（1ml/份），-20℃密封、避光保存，有效期约6个月；忌反复冻融，反复冻融会导致X-Gal降解、显色效果下降，按需分装可有效避免此问题；若发现溶液出现浑浊、沉淀、发黄等现象，表明X-Gal已降解失效，需丢弃重配。

5.  溶解操作要点：X-Gal溶解速度较慢，可借助涡旋振荡器振荡辅助溶解，切勿加热（高温会导致X-Gal变性、DMF挥发过快）；若有少量未溶解颗粒，可静置5-10分钟，轻轻颠倒混匀，直至完全溶解，不可强行搅拌（避免产生气泡，影响后续分装）。

6.  废液与废弃物处理：配制过程中产生的废液（如剩余DMF、未溶解的X-Gal残渣）、废弃的X-Gal溶液及沾染试剂的器皿，需收集至专门的有机溶剂废液桶中，做好标记，交由专业机构集中处理，严禁直接倒入下水道（会污染环境、腐蚀管道）；沾染X-Gal的手套、纸巾等废弃物，需放入有害废弃物垃圾桶，不可随意丢弃。

7.  浓度控制要点：X-Gal母液终浓度需精准控制在20mg/ml。

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