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蛋白杂质总是去不掉？这份蛋白酶K配方请收好
提DNA的同学都懂——细胞裂解完了，蛋白还在里面“捣乱”，酚氯仿抽提不干净、过柱堵得心慌、跑胶条带拖尾严重。蛋白去不掉，核酸就纯不了。传统方法要么用苯酚暴力抽提（毒性大还麻烦），要么靠高温煮蛋白（凝集后仍需离心去除，操作繁琐）。那有没有一种温和、高效、操作简单的蛋白清除方案？
蛋白酶K（Proteinase K）是一种来源于林伯氏白色念珠菌（Tritirachium album）的丝氨酸蛋白酶。它的名字里带个“K”，不是因为跟钾离子有关，而是因为它能消化角蛋白（Keratin）——一种特别顽固的结构蛋白。
它的核心优势就三个字：广、稳、狠。
广：切割范围广，能切断脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。
稳：在SDS、尿素等变性剂以及EDTA等螯合剂存在下依然保持高活性。
狠：在很宽的pH范围（pH 4.0-12.5）内都有效。
正因为这些特性，蛋白酶K成为核酸提取中去除蛋白质杂质的首选工具——它能把你样品里的组蛋白、酶蛋白、角蛋白统统消化掉，只留下干净的DNA/RNA。
蛋白酶K的使用涉及两种配方：储存液（长期保存用）和反应/裂解缓冲液（消化蛋白用）。
配方类型 | 核心成分 | 浓度 | 核心作用 |
储存液 | 蛋白酶K干粉 | 20 mg/mL | 高浓度储备，-20℃长期保存 |
无核酸酶水 | 余量 | 溶解酶蛋白 | |
反应缓冲液（推荐） | Tris-HCl（pH 7.5-8.0） | 50 mM | 维持适宜pH环境 |
CaCl₂ | 10 mM | 保护酶活性中心，提高热稳定性 | |
裂解缓冲液（DNA提取） | Tris-HCl（pH 8.0） | 10 mM | 维持pH |
NaCl | 100 mM | 提供离子强度 | |
EDTA（pH 8.0） | 10 mM | 螯合金属离子，抑制核酸酶 | |
SDS | 0.50% | 裂解细胞膜，变性蛋白 | |
蛋白酶K（工作浓度） | 50-200 μg/mL | 消化蛋白质 |
配比仅供参考，不同实验场景需调整。
第一步：配制20 mg/mL蛋白酶K储存液（以10 mL为例）[1][2]
1. 称取200 mg蛋白酶K干粉。
2. 加入约9.5 mL无核酸酶水。
3. 轻轻摇动直至完全溶解——不建议涡旋（涡旋产生的气泡和泡沫可能导致酶蛋白在气液界面变性，造成活性损失）。
4. 补加无核酸酶水定容至10 mL。
5. 分装成小份（如每管100-200 μL），-20℃避光保存，避免反复冻融。有效期：-20℃保存可达12个月。
第二步：配制蛋白酶K反应/裂解缓冲液
方案A——推荐反应缓冲液（用于常规蛋白酶K消化） ：
组分 | 终浓度 | 配制用量（以1 L计） |
1 M Tris-HCl（pH 7.5） | 50 mM | 50 mL |
1 M CaCl₂ | 10 mM | 10 mL |
无核酸酶水 | — | 补足至1 L |
充分混匀后用pH计确认pH是否为7.5（若偏离可用HCl或NaOH微调），0.22 μm滤膜过滤除菌。
方案B——组织/细胞裂解缓冲液（用于DNA提取） ：[4]
组分 | 终浓度 | 配制用量（以500 mL计） |
1 M Tris-HCl（pH 8.0） | 10 mM | 5 mL |
5 M NaCl | 100 mM | 10 mL |
0.5 M EDTA（pH 8.0） | 10 mM | 10 mL |
10% SDS | 0.50% | 25 mL |
无核酸酶水 | — | 补足至500 mL |
配制后调pH至8.0。[3]使用时，按每1 mL裂解缓冲液加入5-10 μL 20 mg/mL蛋白酶K储存液（终浓度约100-200 μg/mL），难裂解样本可提高至400 μg/mL。
Ca²⁺是蛋白酶K的必需辅因子。方案A反应缓冲液中需添加CaCl₂；方案B裂解缓冲液含SDS，无需额外添加CaCl₂——SDS本身可充分激活蛋白酶K活性，且Ca²⁺与SDS可能产生沉淀，故常规裂解缓冲液配方中不含CaCl₂。
SDS可提高酶活性——在0.2%-1% SDS存在下，蛋白酶K活性更高。
蛋白酶K的最佳反应温度是65℃，但在此温度下酶自身也会快速降解（自溶），实际常用温度50-55℃——在活性和稳定性之间取得平衡。
抑制剂：蛋白酶K可被PMSF（苯甲基磺酰氟） 等丝氨酸蛋白酶抑制剂所抑制。
消化时间根据样本类型而定——溶液中少量蛋白约15-30分钟；细胞裂解液约1-2小时；顽固组织（如鼠尾、皮肤）建议过夜消化（12-16小时）。
消化完成后，如需去除蛋白酶K活性，可加热至95℃ 10分钟灭活。
自己配制虽然原料简单，但蛋白酶K干粉的称量精度、无菌操作、分装保存——每一步都影响酶活性。如果追求省心省力，可以直接选择成熟的商业化产品。
杭州富沃克生物科技有限公司推出的蛋白酶K溶液 ，经纯化去除了DNase和RNase活性，无菌过滤，即开即用。适用于基因组DNA抽提、蛋白质消化去除、原位杂交前处理等多种分子生物学实验场景。产品已优化储存缓冲液配方，-20℃保存稳定，省去自行配制的繁琐与品质波动风险。
产品名称 | 规格 | 产品货号 |
蛋白酶Ｋ | 1ml/10ml | DBM606-01 |
杭州富沃克生物科技有限公司
厂家联系微信号：19850855600
官网链接：蛋白酶K（Proteinase K）-杭州富沃克生物科技有限公司
[1] 蛋白酶K配制、使用方法及作用[EB/OL]. Acmec Biochemical Technology, 2018-09-30.
[2] 蛋白酶K的作用及使用方法[EB/OL]. Solarbio, 2025-09-24.
[3] Merck蛋白酶K[EB/OL]. Merck, 2023-08-16.
[4] DNA Isolation from Tails - Proteinase K Method[EB/OL]. MIT Jacks Lab.
[5] Kawasaki ES. Amplification of RNA. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. San Diego: Academic Press; 1990:146-152.
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