5×SDS-PAGE Loading Buffer – 5倍浓缩蛋白上样缓冲液（5ml 配制）

5×SDS-PAGE Loading Buffer – 5倍浓缩蛋白上样缓冲液（5ml 配制）

产品用途

5×SDS-PAGE Loading Buffer是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中蛋白质样品制备的关键试剂。含SDS阴离子去污剂使蛋白质变性并携带负电荷，消除蛋白质天然电荷和构象差异，使蛋白分子量成为电泳迁移率的唯一决定因素；β-巯基乙醇（2-ME）作为还原剂断裂蛋白质分子内和分子间的二硫键，使多亚基蛋白解聚为单条多肽链；溴酚蓝（BPB）作为示踪染料指示电泳前沿；甘油增加样品密度确保样品沉入加样孔底部。本品为5倍浓缩液，使用时按比例与蛋白样品稀释混合。

核心组分及终浓度（5×）

• 250 mM Tris-HCl（pH 6.8） – 维持稳定的弱碱性缓冲环境

• 10%（W/V）SDS – 阴离子去污剂，使蛋白变性并带负电荷

• 0.5%（W/V）溴酚蓝（BPB） – 电泳前沿指示染料

• 50%（V/V）甘油 – 增加样品密度，确保样品沉入点样孔

• 5%（V/V）β-巯基乙醇（2-ME） – 还原剂，断裂二硫键（使用前加入）

配制方法（5ml 体系）

1. 量取以下各组分，置于10ml塑料离心管中：

• 1.25 ml 1M Tris-HCl（pH 6.8）

• 0.5 g SDS

• 25 mg 溴酚蓝（BPB）

• 2.5 ml 甘油

2. 加去离子水溶解，定容至 5ml，充分混匀。

3. 小份分装（500μl/份），于室温保存（此为不含2-ME的预混液）。

4. 使用前，将 25μl β-巯基乙醇（2-ME） 加入到每小份（500μl）中。

5. 加入2-ME后的Loading Buffer可在室温保存约一个月。

使用方法

• 工作浓度：本品为5×浓缩液，上样时按1:5比例与蛋白样品混合（如4μl蛋白样品 + 1μl 5×Loading Buffer）。

• 热变性：混合后于95～100℃加热5～10分钟，使蛋白质充分变性，冷却后短暂离心即可上样。

• 上样量：通常每个加样孔上样10～20μl（总蛋白量10～50μg），具体依实验需求调整。

各组分功能详解

关键操作要点

• β-巯基乙醇安全操作（最重要）：β-巯基乙醇（2-ME）具有剧毒且散发难闻恶臭，操作时必须在通风橱内进行，务必佩戴手套和护目镜。取用后及时盖紧瓶盖，避免挥发。

• 2-ME使用前加入：β-巯基乙醇易挥发和氧化，不可预先加入长期保存。建议分装不含2-ME的预混液（室温保存），使用前再按比例加入2-ME。

• 颜色变化（正常现象）：加入β-ME后，溶液颜色可能从深蓝色变为蓝绿色或黄色，此乃溴酚蓝与还原剂之间的酸碱反应，属于正常现象，不影响使用效果。

• 有效期：加入2-ME后的Loading Buffer约可室温保存1个月。若颜色明显褪去或出现沉淀，说明还原剂已失效或组分变质，应重新配制。

• 分装建议：不含2-ME的预混液可室温长期保存，推荐分装成小份（500μl/份）方便取用，避免大瓶反复开盖污染。

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