一般固体培养基配制 – 琼脂/琼脂糖平板与顶层琼脂通用方法

一般固体培养基配制 – 琼脂/琼脂糖平板与顶层琼脂通用方法

产品用途

本方案提供分子生物学实验中固体培养基平板和顶层琼脂的通用配制方法，适用于LB培养基、TB培养基、SOB培养基、2×YT培养基、NZ系列培养基等各种液体培养基的固化。固体培养基平板（含琼脂或琼脂糖）用于细菌/噬菌体的分离培养、单菌落筛选、转化子筛选、蓝白斑筛选、菌种保存等实验；顶层琼脂（软琼脂）用于噬菌体滴度测定（噬菌斑检测）、噬菌体感染实验、转化子铺板等需半固体培养基覆盖的特定实验。琼脂（Agar）为微生物培养最常用的凝固剂，成本低、凝固性好；琼脂糖（Agarose）为高度纯化的琼脂组分，透明度更高，适用于需高分辨率的实验。

两种凝固剂对比

配制方法（通用流程）

1. 准备液体培养基：按照液体培养基配方配制好基础液体培养基（如LB、TB、SOB等）。

2. 加入凝固剂：在高温高压灭菌前，根据实验需求选择并加入以下试剂之一：

• Agar（琼脂）：15g/L（铺制平板用）

• Agar（琼脂）：7g/L（配制顶层琼脂用）

• Agarose（琼脂糖）：15g/L（铺制平板用）

• Agarose（琼脂糖）：7g/L（配制顶层琼脂用）

3. 高温高压灭菌：121℃，20min。

4. 混匀：灭菌后戴上隔热手套取出培养基，摇动容器使琼脂或琼脂糖充分混匀（此时培养基温度很高，小心烫伤）。

5. 冷却至加药温度：待培养基自然冷却至50～60℃（手触瓶壁感觉温热但不烫手为宜）。

6. 加入热不稳定物质（如需要）：在超净台内加入抗生素（Ampicillin、Kanamycin等）、IPTG、X-Gal等热不稳定物质，摇动容器充分混匀。

7. 铺制平板：将培养基倒入无菌培养皿中，30～35ml培养基/90mm培养皿。

8. 凝固与保存：室温静置至完全凝固（约30分钟），倒置存放，避免冷凝水滴落于培养基表面。

各凝固剂功能详解

各抗生素/添加剂加入量参考（以1L培养基计）

关键操作要点

• 凝固剂防潮与精准称量（最重要）：Agar和Agarose易吸潮结块，需精准称量并快速操作，称量后立即密封试剂瓶。加入基础培养基后充分搅拌至无颗粒，避免铺板后出现凝固不均、气泡等问题，影响平板质量。

• 灭菌后充分混匀（重要）：灭菌后琼脂/琼脂糖会分层沉淀，灭菌后取出需立即摇动容器使凝固剂充分混匀，否则上层浓度偏低、下层浓度过高，平板凝固不均匀。

• 温度控制（重要）：加入抗生素等热不稳定物质时，培养基必须冷却至50～60℃，温度过高会破坏抗生素活性；温度过低（<40℃）会导致琼脂提前凝固，无法混匀。

• 防烫伤：灭菌后培养基温度极高（>100℃），取放容器必须佩戴隔热手套，摇动时动作轻柔，防止培养基溅出烫伤。

• 倒置保存：平板凝固后必须倒置存放（盖朝下），防止冷凝水滴落至培养基表面，导致菌落扩散或污染。

• 平板厚度：30～35ml/90mm培养皿是标准用量，过薄（<25ml）平板容易干裂，过厚（>40ml）浪费且凝固时间延长。

常见问题排查

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