LB/Amp/X-Gal/IPTG平板 – 蓝白斑筛选琼脂平板（1L 配制）

LB/Amp/X-Gal/IPTG平板 – 蓝白斑筛选琼脂平板（1L 配制）

产品用途

LB/Amp/X-Gal/IPTG平板是分子生物学中蓝白斑筛选实验的标准筛选平板，用于鉴别携带外源DNA插入片段的重组克隆与空载体克隆。本产品在LB/Amp筛选平板基础上添加了X-Gal（显色底物）和IPTG（lac启动子诱导剂），通过α-肽段互补（α-complementation）原理实现蓝白斑筛选。

筛选原理：含有lacZα基因的载体（如pUC19、pBluescript等）转化至lacZΔM15宿主菌（如DH5α、JM109、XL1-Blue等）后，载体编码的α-肽段与宿主菌基因组编码的β-半乳糖苷酶ω-肽段互补形成有活性的β-半乳糖苷酶。该酶水解X-Gal生成蓝色沉淀，形成蓝色菌落。当外源DNA插入多克隆位点破坏lacZα阅读框时，β-半乳糖苷酶失活，菌落呈白色（白色菌落为重组阳性克隆）。本产品是分子克隆中连接产物转化筛选、重组子鉴定的核心筛选工具。

核心组分及终浓度

• 1%（W/V）Tryptone（胰蛋白胨） – 提供氮源、氨基酸和肽类

• 0.5%（W/V）Yeast Extract（酵母提取物） – 提供维生素、生长因子和核苷酸

• 1%（W/V）NaCl（氯化钠） – 维持渗透压和离子环境

• 0.1mg/ml Ampicillin（氨苄青霉素） – 抗性筛选压力

• 0.024mg/ml IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷） – lac启动子诱导剂

• 0.04mg/ml X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷） – β-半乳糖苷酶显色底物

• 1.5%（W/V）Agar（琼脂） – 培养基凝固剂

• pH 7.0

配制方法（1L 体系）

第一步：配制基础培养基

1. 称取以下各组分，置于1L烧杯中：

• 10g Tryptone

• 5g Yeast Extract

• 10g NaCl

2. 加入约 800ml 去离子水，磁力搅拌至完全溶解。

3. 滴加 5N NaOH（约0.2ml），用pH计调节pH至 7.0。

4. 加去离子水定容至 1L，充分混匀。

5. 加入 15g Agar，混匀。

6. 高温高压灭菌（121℃，20min）。

7. 灭菌后冷却至 60℃（水浴或室温自然冷却）。

第二步：添加筛选试剂

1. 在超净台内无菌操作，按以下顺序加入并充分混匀：

• 1ml Ampicillin（100mg/ml）

• 1ml IPTG（24mg/ml）

• 2ml X-Gal（20mg/ml）

2. 加药后快速摇匀，避免局部浓度过高。

第三步：铺制平板

1. 将培养基倒入无菌90mm培养皿中，30～35ml/皿。

2. 室温静置至完全凝固（约30分钟）。

3. 平板凝固后倒置存放。

4. 4℃避光密封保存。

各组分功能详解

使用与保存方法

• 涂布转化产物：将转化后的菌液涂布于平板上，37℃倒置培养12～16小时。

• 结果判读：

• 蓝色菌落 – 空载体或非重组质粒（无外源片段插入，lacZα完整）

• 白色菌落 – 重组阳性克隆（外源片段插入破坏lacZα）

• 挑取白色菌落进行后续分析（质粒提取、PCR鉴定、测序等）。

• 保存：4℃避光密封保存，有效期1～2周（含X-Gal的平板光敏性高，久置显色效率下降）。

• 尽快使用：含Ampicillin和X-Gal的平板不宜长期保存，建议1～2周内用完。

关键操作要点

• X-Gal全程避光（最重要）：X-Gal为光敏试剂，称量、溶解、分装、添加及平板保存全程须避光操作。添加剂应-20℃储存，使用前解冻摇匀。

• 冷却至60℃再加药（重要）：Ampicillin、IPTG和X-Gal均不耐高温，必须待培养基冷却至60℃后再无菌添加，严禁高温时加入导致活性丧失。

• 无菌操作与防交叉污染（重要）：加药全程在超净台内进行，专人专管移液管，防止交叉污染。加药后快速摇匀，确保试剂在培养基中均匀分布。

• 倒置保存：平板凝固后必须倒置（盖朝下）存放，防止冷凝水滴落导致菌落扩散或污染。

• 4℃避光密封：平板应4℃避光密封保存，尽快使用，防污染及X-Gal失效。

• 抗生素与添加剂的添加顺序：先加Ampicillin，再加IPTG和X-Gal，或三者同时加入后快速混匀，顺序不影响效果。

常见问题排查

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