ECL发光液怎么选怎么用？从原理到避坑，一篇讲透（附商品化方案）

做Western Blot的同学都懂——二抗孵育完，满怀期待去暗房显影，结果要么背景黑得跟锅底一样，要么目标条带弱到几乎看不见。抗体没问题、封闭也做了、曝光时间也调了，可结果就是不稳定。排查了一圈，最后发现是发光液出了问题。那ECL发光液到底是什么？怎么配才靠谱？

一、ECL化学发光底物是什么？

ECL，全称增强型化学发光（Enhanced Chemiluminescence），是一种基于鲁米诺（Luminol）的HRP化学发光检测系统[3][5]。说白了就是：辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，催化发光液发出荧光，让X光胶片或成像仪记录下来。

反应原理很简单：发光液中的鲁米诺在HRP催化下，被过氧化氢（H₂O₂） 氧化生成激发态中间体，当它回到基态时释放出光子（波长约425nm）[1][2]。发光液中的增强剂能大幅延长发光时间、提升信号强度[1][2]，让低丰度蛋白也能被检测到。

注：文献[1]中A/B液定义与本表相反，本文仅引用其原理描述。

超敏ECL底物检测灵敏度可达飞克（fg）级，信号强度比传统试剂提升10-100倍[4]。

注：市面上也存在单组份即用型ECL发光液[5]，无需A/B液混合，使用更为简便，但本文以经典的双组分体系为例进行介绍。

二、配方成分与表格

超敏ECL化学发光底物通常分为A液和B液双组分[3]。下表整理了常见配方成分及作用[2][3][4][5]：

配比仅供参考，不同品牌和配方体系间存在差异。A液和B液必须分开保存，使用前等体积混合[3]。

三、配制步骤（以现配现用的工作液为例）

1. 将试剂平衡至室温

2. 从4℃取出A液和B液，室温平衡10-15分钟[4]。

3. 等体积混合A液和B液

4. 根据实验需要量，将A液和B液按1:1体积比混合[4]。例如需要10 mL工作液，就取5 mL A液 + 5 mL B液。

5. 充分混匀

6. 轻轻颠倒或旋涡混匀，避免剧烈振荡产生气泡[4]。

7. 立即使用或避光短时保存

8. 工作液必须现配现用[4]，混合后应在数小时内使用完毕[3]。如需短时保存，需避光放置。

 关键提醒：

l A液和B液吸取时必须更换枪头[3]——相互污染会导致试剂逐渐失效。

l 工作液必须现配现用[4]——混合后灵敏度会随时间下降。

l 用量标准：每10 cm²膜面积约需1 mL工作液[4]。

l 孵育时间：工作液与膜孵育1-5分钟即可曝光[4]。

l 避光保存：A液和B液需在4℃避光条件下保存[3][4]。

l 避免接触强氧化剂[3]——如次氯酸钠等会影响工作液性能。

l 避免反复冻融——反复冻融会破坏A/B液中的活性成分，导致信号下降[2]。

l 若B液（H₂O₂）失效：可按每10 mL纯水加入40 μL 30% H₂O₂的比例临时配制新鲜H₂O₂溶液替代B液使用[2]。

四、商业化便捷选择——杭州富沃克生物

自己配制ECL发光液虽然听起来原理清晰，但鲁米诺的精确浓度、增强剂的筛选与复配、H₂O₂的稳定性保护——每一步都需要大量的筛选和验证工作。如果追求省心省力，可以直接选择成熟的商业化产品。

杭州富沃克生物科技有限公司推出的超敏ECL化学发光底物，采用新型高效增强剂配方，发光强度比传统ECL显色液大幅提升，检测灵敏度可达飞克（fg）级。A液与B液双组分设计，即开即用，按1:1等体积混合即可获得工作液。产品背景低、信号持久稳定，适用于Western Blot、Southern Blot、Northern Blot及EMSA等多种HRP检测场景。省去自行配制的繁琐与批次波动风险。

邮箱：support@fwkbio.com

厂家联系微信号：19850855600

官网链接：ECL 超敏发光液-杭州富沃克生物科技有限公司

参考文献

[1] ECL发光液（HRP发光底物液）[EB/OL]. 生物谷（BioMart）, 2025-07-15.

[2] 极超敏ECL化学发光即用型底物[EB/OL]. ChemicalBook, 2020-03-13.

[3] 超敏ECL发光试剂盒[EB/OL]. 生物谷（BioMart）.

[4] Superbrilliant® 超敏Plus ECL化学发光底物（ZS-PR22004）产品说明书[EB/OL]. 中杉金桥（ZSGB-BIO）.

[5] ECL[EB/OL]. 百度百科, 2026-03-12.